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摘要

 采用压力读取式体外产气法，研究了肉桂油、牛至油及其主要成分肉桂醛、香芹酚在0（对照组）、50、200、500、750mg/L5个水平下添加对瘤胃甲烷产量、氨氮浓度、各挥发酸浓度等指标的影响。

结果表明，添加植物挥发油及其主要单体时，瘤胃甲烷和总挥发性脂肪酸产量随添加浓度的增加而降低，但高浓度添加（500，750mg/L）时，显著抑制瘤胃发酵。添加50mg/L的牛至油和肉桂油可分别降低甲烷13.3%和21.2%，而对总挥发性脂肪酸影响较小。200mg/L挥发油添加降低了氨氮浓度和乙丙酸比，但也显著降低了总挥发性脂肪酸。

牛至油和肉桂油对瘤胃发酵的影响与其主要成分肉桂醛、香芹酚具有相似趋势，但香芹酚和肉桂醛对瘤胃发酵的抑制作用强于牛至油和肉桂油；挥发油及其主要组分的添加水平是影响其作用效果的重要因素。

关键词：肉桂油；牛至油；肉桂醛；香芹酚；瘤胃发酵；甲烷产生

反刍动物瘤胃内生成的甲烷作为温室气体的重要来源，日益受到了人们的重视。反刍动物瘤胃产生的甲烷占全球甲烷排放总量的15%～30%，同时占动物饲料总能的5%～12%，甲烷排放既加剧了温室效应，又降低了饲料利用率。因此，研究降低瘤胃甲烷排放的措施和新型添加剂已成为目前研究的热点之一。

近年来，许多研究报道植物挥发油作为一种高效、天然的抗菌物质，添加到瘤胃内具有降低甲烷、降低乙酸/丙酸比例和提高氮存留率的功能。然而挥发油成分因植物种类、提取方法和部位等不同而差异很大，有必要阐明其主要成分的抑菌活性和对瘤胃发酵调控的机理。

不同植物源的挥发油根据其主要成分可以分为单萜类（如茴香草油）、醛类（如肉桂油）和酚类（如牛至油），研究表明后两类挥发油的主要成分肉桂醛和香芹酚的抑菌活性较强，且对瘤胃发酵表现出不同的影响。不同挥发油的作用效果和机制的差异主要是由于其主要成分不同所致，但植物挥发油成分单体能否替代天然挥发油调控瘤胃发酵尚有待研究。

因此，本研究通过体外产气试验评价肉桂油和牛至油以及各自的主要成分肉桂醛和香芹酚对瘤胃甲烷产量和发酵参数的影响，旨在获取挥发油与其主要成分的有效添加浓度，以及比较其效果。

1 材料与方法

1.1 材料

天然提取的植物挥发油：肉桂油、牛至油购自江西振兴香料油提炼厂，提取方法为水蒸汽蒸馏法。肉桂油的气质联用分析共分离出53种成分，经质谱鉴定出33种成分，主要组分有反式肉桂醛、苯乙醇、苯乙醛、柠檬醛等，其中反式肉桂醛和苯乙醛含量分别是85.53%和7.32%。

牛至油的气质联用分析共分离出26种成分，经质谱鉴定13种成分，主要组分有香芹酚、2-甲基苯酚、麝香草酚等，其中香芹酚含量是83.74%，香芹酚的类似物占总量的6.97%。肉桂油的主要组分肉桂醛和牛至油的主要组分香芹酚分别购自阿拉丁试剂公司，两者纯度均在98%以上。

1.2 体外瘤胃发酵试验设计

试验采用按4×5双因子试验设计，因子一为挥发油种类，分别为肉桂油、肉桂醛、牛至油、香芹酚；因子二为添加水平，分别为0，50，200，500，750mg/L，每个浓度做4个重复。由于挥发油与水不相溶，为使挥发油均匀分布到瘤胃液内，本试验采用吐温80作为乳化剂，用0.2%的吐温80乳化挥发油或单体后备用。

1.3 体外培养

体外产气试验按照文献的压力读取式体外产气法进行，缓冲液按文献方法配制，各培养瓶中加入粉碎玉米和羊草粉各（375±0.4）mg（DM），然后加入90mL缓冲液，将产气瓶用CO2气体饱和后密闭，并于39.5℃的培养箱中预培养过夜。次日清晨，取10mL新鲜瘤胃液于产气瓶中，混匀。然后将产气瓶放置于39℃的恒温培养箱中培养，培养时间为24h。

1.4 测定指标及方法

培养12、24h后测定甲烷产量，用压力传感器及配套软件测定12、24h产气压力，并用相应公式转变成产气量。24h培养后，取5mL发酵培养液冷冻保存待测定氨氮和挥发性脂肪酸（VFA）浓度。甲烷和VFA均采用岛津2010气相色谱仪器测定，具体方法参照胡伟莲等方法进行。氨氮参照冯宗慈等方法采用比色法进行。

1.5 统计分析

采用SAS软件的广义线性模型（GLM）对挥发性脂肪、产甲烷量、产气量、氨态氮、乙酸/丙酸比值、pH值进行二因素方差分析和显著性检验，多重比较采用Duncan氏法。

2 结果

2.1 挥发油及其活性单体对VFA和甲烷的影响

挥发油及其活性单体对VFA和甲烷的影响总结于表1，其数值表示与对照组相比各添加组的降低幅度。随挥发油添加浓度的升高，甲烷和总VFA产量均逐渐降低。高质量浓度（500、750mg/L）添加时，无论哪种挥发油其甲烷产量均低于空白对照（降低比例大于100%），但总VFA也降低了90%以上，说明添加500mg/L以上时，对瘤胃发酵的抑制很大，没有实际意义。

在低质量浓度（50、200mg/L）下，肉桂醛和肉桂油对甲烷的抑制程度在数值上大于牛至油和香芹酚，而肉桂醛和香芹酚的效果又大于与其对应的油———肉桂油和牛至油。

50mg/L的香芹酚、牛至油、肉桂醛、肉桂油对总VFA的影响均在5%左右，牛至油还提高了总VFA产量0.8%，而甲烷产量分别降低了8.1%、13.3%、16.5%、21.4%，说明该浓度挥发油发挥了理想的瘤胃调控作用。

200mg/L浓度下，各添加物的甲烷虽然相比50mg/L均显著降低（P<0.05），比对照组降低幅度达30%～40%，但总VFA也较对照组降低20%～40%，不利于瘤胃发酵。从乙酸与丙酸比（A/P）看，添加50mg/L的4种挥发油其影响在5%以内，而200mg/L的浓度添加降低A/P比值的幅度为11.7%～28.4%。

图1表示各挥发油添加组总VFA降低幅度同甲烷降低幅度的关系，只有在50mg/L添加浓度下，各组总VFA降低幅度/VFA降低幅度的比值最小，而200mg/L以上各组在降低甲烷的同时也显著抑制了瘤胃发酵。

表1 挥发油添加对瘤胃发酵各指标和甲烷产量的影响 %

注：1.表中数值表示与对照组相比各添加阻的降低幅度，计算方法为（对照组-添加组）/对照组×100%；负值表示该发酵指标相比对照组增加,降低比例>100%表示该指标值低于空白对照；2.NS表示影响不显著，＊表示影响显著（P<0.05），＊＊表示影响极显著（P<0.01）。a～d表示同一指标同一列中数值肩标不同字母表示添加浓度间差异显著（P<0.05）。

图1 总VFA降低幅度/甲烷降低幅度之比随挥发油添加浓度的变化趋势

总VFA降低幅度/甲烷降低幅度之比值（y 轴）越小，表明挥发油对甲烷抑制程度越大，而对总VFA影响越小, 从而有利于瘤胃发酵。

2.2 挥发油及其活性单体对产气量、氨氮浓度和pH的影响

4种添加物对产气量、氨氮浓度和pH的影响见表1。随挥发油或其成分添加浓度的升高，体外发酵产气量逐渐降低，4者对瘤胃产气量的降低趋势具有一致性。总体而言，瘤胃氨氮浓度随挥发油添加量增加呈逐渐升高的趋势，但在200mg/L浓度下添加时氨氮浓度较对照组均显著降低（P<0.05），肉桂醛和肉桂油降低的比例在数值上大于牛至油和香芹酚，肉桂醛降低比例最大为15.3%。

高质量浓度下（500和750mg/L）条件下，氨氮浓度则较对照组显著升高（P<0.05）。对瘤胃pH值而言，各组差异与对照组相比有升高或降低，但变化幅度均较小，与对照组的差异均在±1。在750mg/L添加浓度下，各组pH值均较对照组提高。

3 讨论

3.1 挥发油及其活性单体对VFA和甲烷产量的影响

体外发酵体系中添加挥发油，甲烷产量随添加浓度的升高而逐渐降低，但也伴随着瘤胃发酵的抑制。本试验中挥发油仅在50mg/L浓度下甲烷降幅远大于VFA降幅，50mg/L的牛至油组VFA有所增加，而50mg/L肉桂油组甲烷降低幅度最大。200mg/L以上的挥发油添加使瘤胃总VFA急剧降低（20%～100%），不利于瘤胃发酵。

Busquet等对香芹酚、牛至油、肉桂醛、肉桂油的体外研究表明，300mg/L添加浓度下，VFA的降幅为5%～15%，低于本研究，原因可能是Busquet等的底物营养价值较高（蛋白18%，NDF28%）。挥发油降低甲烷的机制之一是抑制瘤胃原虫，进而抑制与原虫共生的甲烷菌，此外挥发油对真菌也有抑制作用，因此高浓度挥发油可能会抑制瘤胃原虫和真菌对瘤胃纤维消化，引起总VFA的降低。这可能是挥发油在高精日粮或偏酸性瘤胃环境相比高粗日粮能更好调控瘤胃发酵的原因。

本研究发现，挥发油的种类（以醛或以酚为主要成分）对瘤胃发酵的调控无明显差异，但添加浓度非常重要，只有50mg/L挥发油降低了甲烷而对瘤胃发酵无显著抑制。Kamra等用体外产气法对茴香、苜蓿、大蒜等的乙醇提取物抑制甲烷生成的效果进行研究，结果表明大蒜提取物降低了64%的甲烷且对饲料消化率没有负效应。

Bodas等筛选出6种富含挥发油的植物，将其细粉添加到体外发酵底物中，可降低瘤胃甲烷产量25%以上。体内试验方面，在羔羊日粮添加0.2g/kg的香芹酚或肉桂醛，显著降低了瘤胃pH值，增加了VFA浓度且不影响采食量，表明添加挥发油单体对羔羊瘤胃发酵无不利影响。可见，选择适当的植物挥发油，在适当添加浓度下可有效调控瘤胃发酵。

3.2 挥发油与其活性单体对瘤胃发酵指标影响的差异

挥发油主要成分的化学结构决定了其作用机制的不同。有报道认为牛至油和肉桂油对瘤胃发酵影响的差异是由于其主要活性成分香芹酚和肉桂醛化学结构不同，本研究也发现以肉桂醛为主的肉桂油在低浓度下对瘤胃的作用效果强于香芹酚为主的挥发油。

Macheboeuf等的研究认为，香芹酚和肉桂醛是酚类和醛类挥发油中抑菌作用最强的，只有低浓度才可发挥瘤胃调控功能。香芹酚的抑菌机制是增加细胞膜流动性和通透性，干扰膜蛋白功能导致细胞解体，此外还可通过破坏细胞质子流动影响细胞ATP库；肉桂醛的抗菌机制是结合在蛋白上并干扰细胞的能量代谢，两者作用机制的不同是其对瘤胃发酵影响不同的原因。较多的研究认为挥发油中其他微量成分对挥发油作用可起协同作用。

本研究发现牛至油和肉桂油的产气量和VFA降低程度在数值上较香芹酚和肉桂醛低，说明挥发油中的少量成分可能调节了单体成分对微生物的抑制作用。

3.3 挥发油及其活性单体对瘤胃发酵产气量、氨氮和pH值的影响

本研究中产气量也随挥发油浓度增加而降低，但其降幅远低于总VFA降幅，其原因可能是甲烷生成受到抑制，引起气体成分中CO2和H2累积，从而使两者抵消了甲烷降低的缘故。高浓度挥发油（500和750mg/L）添加使总VFA降低95%～100%的状况下，体外发酵体系中仍有气体产生的原因有待进一步研究。

氨是饲料蛋白的降解产物，也是瘤胃微生物生长的主要氮源。原虫在瘤胃内具有较强的脱氨基能力，但不能利用氨氮生长，是一种氨氮净产生微生物，驱原虫可降低氨氮浓度，提高瘤胃氮存留率。此外，研究表明，挥发油还可抑制Clostridium sticklandii和Peptostreptococcus anaerobius等多种瘤胃产氨细菌。

Benchaar等综述了多个挥发油调控瘤胃发酵的研究结果，认为挥发油较低氨氮的重要原因在于抑制瘤胃产氨菌。因此，本研究中200mg/L挥发油降低瘤胃氨氮的原因可能是瘤胃原虫和产氨细菌被抑制的综合结果。各种添加物pH值仅在750mg/L添加时有所升高，其余各浓度变化不明显，可能是试验采用100mL发酵缓冲液，体系缓冲能力较强，从而掩盖总VFA变化而引起了pH改变。

作者：林波，纪苗苗，梁权，陆燕，刘建新

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